缺氧誘導的lncRNA-AC020978促進非小細胞肺癌的增殖和糖酵解代謝
欄目:最新研究動態 發布時間:2020-07-06
非小細胞肺癌(NSCLC)是一種以代謝異常為特征的致死性疾病。糖酵解相關的lncRNA在NSCLC侵襲行為中的作用機制尚不清楚...

    非小細胞肺癌(NSCLC)是一種以代謝異常為特征的致死性疾病。糖酵解相關的lncRNA在NSCLC侵襲行為中的作用機制尚不清楚。因此小編為大家詳細介紹發表于“Theranostics”上的文章“Hypoxia-induced lncRNA-AC020978 promotes proliferation and glycolytic metabolism of non-small cell lung cancer by regulating PKM2/HIF-1α axis”,讓大家了解lncRNA-AC020978促進非小細胞肺癌的增殖和糖酵解代謝的分子機制。

    在本研究中,我們采用實時定量PCR和熒光原位雜交技術檢測AC020978在NSCLC中的表達水平。通過體內外功能實驗,研究了AC020978在細胞增殖和有氧糖酵解中的生物學作用。采用雙熒光素酶報告基因、染色質免疫沉淀法檢、RNA下拉法等實驗方法研究了AC020978的分子機制。
結果:
1.AC020978在非小細胞肺癌中的臨床意義
    
為了探討AC020978在腫瘤中的臨床意義,我們對NSCLC及其鄰近組織進行了FISH檢測。如圖1A和1D所示,AC020978在腫瘤組織中過表達,在鄰近的非腫瘤組織中很少表達。此外,AC020978的表達隨著TNM的進展而增加(圖1B,1E)。Kaplan-Meier分析顯示AC020978的高表達與這些患者的預后不良顯著相關(P<0.01,圖1C)。
    為進一步評價AC020978的病理和臨床預測價值,對AC020978、TNM和AC020978與TNM聯合應用組進行ROC分析。AUC數據顯示,聯合模型高于單用TNM模型(圖1F)。隨后,我們發現AC020978表達與腫瘤大小、淋巴結轉移和TNM分期顯著相關(圖1G)??傊?,這些結果提示AC020978可能是NSCLC的一個潛在的生物標志物。

2.AC020978是NSCLC細胞中的一種致癌lncRNA
    為了闡明AC020978在細胞生物學行為中的作用,我們用兩種不同的siRNA轉染A549和H1299細胞。Si-0978#1對AC020978的抑制作用最強。qRT-PCR證實AC020978的表達可增加1000倍以上(圖2A)。
    為探討AC020978在NSCLC進展中的生物學作用,采用CCK-8、EdU染色、集落形成分析等方法對細胞增殖進行了研究。結果表明在A549和H1299細胞中,AC020978基因敲除后,細胞增殖顯著減弱。此外,重新表達AC020978可以挽救減弱的細胞增殖率(圖2B-C)。在功能增益分析中,AC020978的過表達加速了H1299細胞的增殖效應(圖2E-2F)。采用Transwell法檢測AC020978在NSCLC細胞中的遷移能力。結果表明,AC020978異位表達的H1299細胞遷移能力增強,而AC020978的下調與陰性對照相比抑制了A549和H1299細胞的遷移活性,而AC020978在穩定的AC020978敲除細胞中的重新表達可以挽救減弱的細胞遷移(圖2D和2G)。

3.AC020978是在代謝應激下誘導的,是糖酵解代謝重編程的關鍵
    
為了闡明AC020978在代謝應激下是否對細胞存活起作用,我們采用2.5mM到25mM的葡萄糖濃度梯度模擬葡萄糖剝奪條件。如圖3A-3D所示,AC020978是由葡萄糖剝奪或2-DG治療以劑量依賴和時間依賴的方式誘導的,表明AC020978可能在細胞對代謝應激的適應中起關鍵作用。
    其次,檢測AC020978是否直接影響葡萄糖代謝。如圖3E和3F所示,AC020978的沉默提高了最大呼吸強度, AC020978的敲除明顯降低了A549細胞的糖酵解、糖酵解能力和糖酵解儲備。相比之下,AC020978的過表達在H1299細胞中表現出相反的代謝通量(圖3G和3H),表明AC020978促進了糖酵解途徑。此外,AC020978下調的A549細胞18F-FDG攝取和乳酸生成顯著減少,而在H1299細胞中異位誘導的AC020978表現出逆轉作用(圖3I-J)。此外,我們還測量了幾種葡萄糖轉運體和代謝酶的蛋白質水平。Western blotting結果顯示,AC020978表達的改變對它們有積極影響(圖3K)。這些數據表明AC020978是一種葡萄糖饑餓誘導的lncRNA,可以調節NSCLC的糖酵解代謝。
    由于HIF-1α是一種轉錄因子,參與調節細胞適應缺氧和低葡萄糖供應的重要基因,因此在葡萄糖饑餓條件下分析了HIF-1α的蛋白水平和反式激活(圖3L)。結果表明,HIF-1α和HIF-1α響應的熒光素酶報告均受低葡萄糖誘導。有趣的是,與較長的供應相比,24小時的HIF-1α蛋白表達最高,而48小時的HIF-1α響應性熒光素酶活性最高,這表明癌細胞可能不斷適應其代謝應激微環境。

4.AC020978促進腫瘤生長和體內有氧糖酵解
    
為了探討AC020978在體內的作用,我們建立了AC020978基因敲除的A549細胞系,并建立異種移植模型。如圖4A-B和4D所示,與對照組相比,AC020978基因敲除顯著降低了腫瘤體積和腫瘤重量。此外,來自對照組的異種移植體具有相對較強的18F-FDG積累,而AC020978下調組的18F-FDG攝取量要低得多(圖4C-4E)。異種移植組織的IHC染色表明AC020978介導腫瘤生長和糖酵解(圖4F-4G)??傊?,這些結果表明AC020978在促進NSCLC增殖和糖酵解方面發揮了重要作用。

5.AC020978是缺氧誘導的HIF-1α直接反式激活因子
    
我們探討了導致非小細胞肺癌AC020978高表達的原因。利用啟動子序列分析工具對編碼AC020978基因進行了檢測。在啟動子區發現兩個假定的HIF-1α結合位點(圖5D)。缺氧或其化學誘導劑CoCl2處理24小時后,A549和H1299細胞中AC020978的表達明顯升高,與HIF-1α表達上調一致(圖5A)。相反,HIF-1α基因敲除顯著抑制AC020978在常氧和缺氧條件下的表達(圖5B-5C)。另外,ChIP-qPCR分析表明HIF-1α直接與AC020978基因兩個預測啟動子區的染色質片段結合(圖5G)。為了進一步驗證HIF-1α對AC020978轉錄的激活作用,進行了熒光素酶報告基因實驗。與預期的一樣,在含有野生型啟動子(WT)的細胞中,缺氧顯著提高了熒光素酶的密度。然而,HIF-1α的敲除顯著抑制了含有WT啟動子的熒光素酶密度(圖5E-F,H-5I)。綜上所述,我們的數據強烈表明AC020978是HIF-1α的直接轉錄靶點。

6.AC020978與PKM2物理結合并介導PKM2蛋白的穩定性
    
我們進行RNA下拉和質譜分析篩選AC020978相互作用蛋白,如圖6A所示。 RIP分析結果表明,在PKM2免疫復合物中,AC020978共沉淀有一個穩定而特異的富集(圖6B)。RNA下拉實驗證實PKM2蛋白特異性地與AC020978的序列結合(圖6C)。
    接下來,我們嘗試探索這種AC020978-PKM2相互作用的分子功能。我們發現AC020978表達的改變調節了PKM2蛋白水平(圖6D)因此,我們推測AC020978可能調節PKM2蛋白的穩定性。我們觀察到,通過在A549細胞中添加MG-132,明顯恢復了通過AC020978下調而降低的PKM2蛋白水平(圖6E)。環己酰亞胺(CHX)實驗結果表明,AC020978下調細胞中PKM2的半衰期較短,而AC020978高表達細胞中PKM2的半衰期較長(圖6F),提示AC020978對PKM2的調控可能是通過抑制蛋白酶體降解來實現的。
    最后,我們通過體外泛素化試驗檢測了AC020978是否參與了泛素介導的PKM2降解。下調AC020978可提高A549細胞PKM2蛋白泛素化水平。泛素介導的PKM2的降解作用在AC020978高表達H1299細胞中被顯著抑制(圖6G)。這些結果表明,AC020978通過泛素介導的蛋白酶體降解有助于維持PKM2蛋白的穩定性。

7.AC020978促進PKM2的核移位并調節PKM2增強的HIF-1α反式激活活性   
    免疫熒光染色顯示,AC020978可調節PKM2的表達。在A549陰性對照細胞中,PKM2主要存在于胞漿中。而在AC020978敲除細胞中,幾乎看不到任何可檢測到的核PKM2。當比較AC020978高表達細胞中PKM2的細胞分布時,可以看到核PKM2水平的增加(圖6H)。對A549和H1299細胞核質和胞質組分的Western blotting分析表明,PKM2主要在胞質組分中表達。A549細胞沉默AC020978后,PKM2的細胞核和胞漿部分信號降低。然而,根據免疫熒光結果(圖6I),異位表達的AC020978表現出一定程度的核和胞漿PKM2信號的增加。
    我們猜測AC020978參與了PKM2/HIF-1α途徑的激活。首先,我們采用co-IP技術探討AC020978是否能調節PKM2與HIF-1α的相互作用。結果表明,敲除AC020978的功能受損,但AC020978的過表達明顯增強了PKM2和HIF-1α的相互作用(圖7A)。此外,為了可視化天然蛋白質復合物,我們使用原位鄰近連接分析(圖7B)。在AC020978沉默條件下,發現含有PKM2和HIF-1α的PLA陽性蛋白復合物較少。相反,在AC020978高表達組中發現PKM2/HIF-1α簇的整體高密度,這與co-IP的蛋白質相互作用結果一致。
    接下來,我們確定AC020978是否調節PKM2刺激的HIF-1α的反式作用。熒光素酶檢測結果表明,在缺氧條件下,PKM2的異位表達均能提高HRE報告活性,而AC020978和PKM2的聯合表達則能協同增強啟動子活性(圖7C)。缺氧條件下檢測HIF-1α靶向基因GLUT1、LDHA、ENO1和PDK1的表達。AC020978和PKM2的共轉染對所有這些基因都表現出較高的表達(圖7D)。綜上所述,這些數據表明AC020978增強PKM2增強HIF-1α轉錄活性。

結 論:
    
AC020978是一種上調的lncRNA,在NSCLC中具有臨床意義,有望成為NSCLC預后預測的獨立生物標志物。靶向AC020978/PKM2/HIF-1α軸可能為NSCLC的防治提供新的視角。

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