自噬與血管重塑
欄目:最新研究動態 發布時間:2020-07-08
跨膜成員16A(TMEM16A)是鈣激活的氯離子通道的一個組成部分,調節血管平滑肌細胞(SMC)的增殖和重塑...

    跨膜成員16A(TMEM16A)是鈣激活的氯離子通道的一個組成部分,調節血管平滑肌細胞(SMC)的增殖和重塑。自噬是真核生物中高度保守的細胞分解代謝過程,在血管平滑肌細胞中發揮著重要的生理功能。TMEM16A是否參與自噬介導的血管重塑尚不清楚。接下來小編為大家帶來發表于“Theranostics”上的文章“TMEM16A ameliorates vascular remodeling by suppressing autophagy via inhibiting Bcl-2–p62 complex formation”。在本研究中,我們研究了自噬對血管內SMC的增殖和重構的貢獻,并研究了TMEM16A是否參與了這些過程。

結 果:
1.自噬水平與血管重塑呈正相關
    
為探討自噬是否參與血管性高血壓誘導的血管重塑,測定了自噬標志物LC3B的蛋白表達。結果顯示,從術后1周開始,AngII誘導的高血壓小鼠主動脈中LC3B-II的表達逐漸增加(圖1A)。此外,AngII灌注顯示主動脈平滑肌中LC3B陽性綠點的數量隨時間而增加,如平滑肌標記物α-SMA(圖1B和C)。盡管AngII引起的血管壁和管腔直徑的減小是輕微的,但與相應的假手術組相比,差異是顯著的(圖1D和E)。因此,從術后1周開始,AngII灌注逐漸增加了中膜厚度和平均內側CSA值(圖1F和G)。值得注意的是,相關分析表明,LC3B點狀結構與血管性高血壓時胸主動脈內側CSA值呈正相關(圖1H),表明自噬可能在血管重塑中發揮作用。

2.TMEM16A抑制大動脈血管中AngII誘導的自噬
    
與假手術小鼠相比,從術后2周開始,AngII高血壓小鼠的主動脈中TMEM16A的表達逐漸減少(圖2A)。有趣的是,TMEM16A表達的降低與AngII高血壓小鼠主動脈中LC3B陽性點狀數目呈負相關(圖2B)。為探討TMEM16A在高血壓大鼠主動脈血管自噬中的作用,制備了TMEM16A-SMC特異性轉基因小鼠(TMSMC-Tg),并注入AngII。如圖2C所示,假手術TMcon和TMSMC-Tg小鼠主動脈中LC3B-II、Beclin-1和p62的表達差異不顯著。然而,與TMcon小鼠相比,TMSMC-Tg小鼠主動脈血管內LC3B-II和Beclin-1表達的增加以及p62表達的減少均受到明顯抑制。免疫熒光染色顯示,SMC特異性TMEM16A的過度表達顯著減弱了AngII誘導的增加的LC3B陽性點狀細胞(圖2D)。進一步的電鏡觀察顯示,與假手術小鼠相比,AngII處理小鼠的胸主動脈中層自噬體增多。TMEM16A上調顯著抑制自噬體的積累(圖2E)。這些數據提示TMEM16A的表達在調節血管自噬中起重要作用。

3.TMEM16A阻斷AngII誘導的自噬通量
    
我們的研究結果顯示,抑制TMSMC-Tg小鼠的AngII誘導的自噬,有助于我們研究TMEM16A在體外是否發揮類似的作用。結果表明,TMEM16A過表達顯著抑制了AngII誘導的LC3B-II和Beclin-1表達的增加以及p62表達的減少(圖3A)。為了區分LC3B-II和Beclin-1水平的升高是由于自噬體形成增加還是自噬體-溶酶體融合受損,我們研究了氯喹(溶酶體抑制劑)對LC3B-II表達的影響。結果表明,在抑制溶酶體活性后,經AngII處理的MASMCs中LC3B-II的表達進一步增強。然而,TMEM16A過表達顯著逆轉了氯喹對LC3B-II表達的影響,提示TMEM16A抑制了自噬小體的形成(圖3B)。為了證實TMEM16A對自噬通量的影響,我們采用串聯的mRFP-GFP-LC3腺病毒進行熒光分析。與mRFP相比,GFP熒光在較高pH值下是最佳的,并且在溶酶體酸性環境中可以更快地猝滅,這使得我們能夠通過分別檢測黃點(GFP+/mRFP+)和紅點(GFP-/mRFP+)來監測自噬體和自溶體。經AngII處理的MASMCs可見豐富的黃色和紅色斑點。然而,異位過表達TMEM16A與單獨使用AngII治療相比,顯著減少了黃點和紅點的數量(圖3C-E),表明TMEM16A通過抑制自噬通量來減弱AngII誘導的自噬。

4.下調TMEM16A促進AngII誘導的自噬通量
    
為了進一步闡明TMEM16A在自噬調節中的作用,我們用siRNA敲除了TMEM16A在MASMCs中的表達。結果表明,TMEM16A基因敲除進一步增強了AngII誘導的LC3B-II和Beclin-1表達增加和p62表達減少(圖4A)。此外,氯喹對經TMEM16A siRNA處理的細胞LC3B-II表達的影響增強(圖4B),表明TMEM16A下調進一步促進自噬體成熟。與單用AngII處理相比,TMEM16A基因敲除顯著增加了黃點和紅點的數量(圖4C-E),表明TMEM16A基因敲除增強了AngII誘導的自噬。

5.TMEM16A抑制AngII誘導的VPS34活性
    
為了確定TMEM16A調節自噬的機制,我們研究了TMEM16A對mTOR途徑的影響。出乎意料的是,與假手術小鼠相比,經AngII處理的小鼠主動脈中AKT、mTOR和下游靶點p70S6K的磷酸化顯著增加,而4-EBP1磷酸化被抑制。相反,SMC特異性TMEM16A過表達顯著抑制了mTOR途徑的激活(圖5A和B)。此外,AngII誘導的高血壓TMSMC-Tg和TMcon小鼠主動脈中VPS34的表達相似(圖5C)。AngII素輸入顯著增加了VPS34的激酶活性,而VPS34被SMC特異性TMEM16A過表達所抑制(圖5D)。
    考慮到TMEM16A和自噬在血管重塑中的作用,以及TMEM16A調節自噬的能力,我們探討了自噬在TMEM16A介導的血管平滑肌細胞增殖和重塑中的作用。結果表明,在基礎條件下,TMcon和TMSMC-Tg小鼠胸主動脈Ki67陽性細胞數和中間CSA值相似。然而,AngII注射顯著增加了TMcon小鼠Ki67染色水平和CSA中間值,而這在TMSMC-Tg小鼠中受到抑制。此外,3-MA,一種靶向VPS34的自噬抑制劑,顯著抑制AngII誘導的血管平滑肌細胞增殖和血管重塑(圖5E和F)。值得注意的是,雷帕霉素,一種通過抑制mTOR信號傳導的自噬刺激劑,并沒有逆轉TMEM16A上調對血管平滑肌細胞增殖和血管重塑的抑制作用,而是增強了這種作用(圖5E和F)。此外,AngII誘導的MASMC增殖被TMEM16A過表達顯著減弱,并被TMEM16A敲除增強(圖5G和H)。VPS34的過表達消除了TMEM16A上調對AngII誘導的細胞增殖的抑制作用(圖5G)。此外,用更高選擇性抑制劑(SAR405)對VPS34的藥理學抑制很大程度上消除了TMEM16A下調引起的細胞增殖增加(圖5H)??傊?,這些結果表明,抑制VPS34介導的自噬是TMEM16A對血管平滑肌細胞增殖和重塑作用的基礎。

6.TMEM16A從p62/Bcl-2/Beclin-1/VPS43復合物中分離p62并抑制自噬的發生
    
為了研究TMEM16A如何減弱VPS34的活性和隨后的自噬通量,我們研究了TMEM16A在調節自噬起始中的作用。結果表明,TMEM16A與p62共免疫沉淀(圖6A和B)。在轉染HA-RFP-TMEM16A和His-p62的細胞中,TMEM16A始終與外源p62相互作用(圖6C和D)。以前有報道稱p62結合Bcl-2并阻止Bcl-2/Beclin-1復合物的形成。Bcl-2-Beclin-1相互作用的中斷促進了Beclin-1-VPS34的關聯,并增加了Beclin-1相關的VPS34活性?;诖?,我們接下來檢查這些相關蛋白質之間的關聯。用AngII處理的MASMCs分別增加了p62-Bcl-2和VPS34-Beclin-1的結合,但減少了與Beclin-1共免疫沉淀的Bcl-2的數量(圖6E-H)。TMEM16A過表達顯著限制了p62-Bcl-2和VPS34-Beclin-1的形成,但逆轉了Bcl-2-Beclin-1結合的減少(圖6E和F)。相反,TMEM16A的抑制增強了p62-Bcl-2和VPS34-Beclin-1的結合,進一步破壞了Bcl-2-Beclin-1復合物的形成(圖6G和H)。這表明TMEM16A至少部分地通過p62、Bcl-2、Beclin-1和VPS34之間的四向相互作用來調節VPS34的活性。

結 論:
    總之,TMEM16A通過調節p62、Bcl-2、Beclin-1和VPS34之間的四向相互作用抑制自噬介導的VSMC增殖,降低VPS34的活性,從而改善血管重塑。這些發現為TMEM16A減輕血管重塑的機制提供了新的見解,并為該病的靶向治療提供了新的思路。


 


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