circRNA促進肝癌干細胞自我更新
欄目:最新研究動態 發布時間:2020-07-09
隨著高通量RNA測序的發展和新穎的計算方法,在真核生物中已發現大量內源的、保守的、穩定的和特異性的環狀RNA...

    隨著高通量RNA測序的發展和新穎的計算方法,在真核生物中已發現大量內源的、保守的、穩定的和特異性的環狀RNA(circRNA)。癌癥干細胞(CSC)具有自我更新潛力,與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關。然而,尚不清楚在癌癥中circRNA如何調控CSC 。今日,小編帶大家一探其奧秘。

技術路線:

結 果:
1. Circ-MALAT1在肝CSCs中高表達
    患者實體瘤中獲得肝細胞癌的原代細胞(HCC)和CSC,進行circRNA-seq,發現共有193個circRNA在肝細胞CSC中異常表達,其中兩個被下調,十八個包括MALAT1在內的circRNA鑒定為異位表達。使用聚合引物和發散引物確認發現的circRNA確實是首尾相連環狀結構,九種候選circRNA對RNase R具有抗性,進一步驗證circRNA的環狀封閉結構。9個中MALAT1呈現出更高的CSCs中的表達水平。

2. Circ-MALAT1促進肝細胞CSCs的自我更新
    與circ-MALAT1側翼結合的剪接相關因子中,AUF1 mRNA在CSC中表達上調,AUF1蛋白與MALAT1前端綁定,Huh7細胞沉默AUF1降低了circ-MALAT1的表達。circ-SPARC在CSC與匹配的臨近細胞之間無差異,作為陰性對照。HCC細胞過表達circ-MALAT1形成更多懸浮球,體內注射的circ-MALAT1過表達細胞導致更大生長更快的腫瘤。這些表明,circ-MALAT1在AUF1的協調下在HCC中促進了CSC進行自我更新。

3.Circ-MALAT1的表達導致JAK2和PAX5的差異表達
    蛋白陣列顯示MALAT1過表達后224個蛋白質上調和43個蛋白質下調,GO分析有96個上調蛋白參與CSCs自我更新或腫瘤轉移和增殖。在三個最顯著富集GO中,選擇五個倍數變化最大的蛋白(FGF2,TGFB1,PTK2,JAK2和GH1)作進一步研究。在43種下調的蛋白中,有10種參與腫瘤抑制。HCC細胞過表達circ-MALAT1后Janus激活激酶2(JAK2)蛋白增加,PAX5下調明顯。敲低circ-MALAT1后結果相反。此外,Huh7細胞circ-MALAT1過表達產生的異種移植腫瘤表現出較高的JAK2和較低的PAX5蛋白表達。這些結果表明circ-MALAT1可能導致肝細胞CSC中JAK2上調和PAX5的下調。

4. Circ-MALAT1通過與PAX5編碼序列和核糖體結合而阻礙PAX5的翻譯
    熒光原位雜交發現circ-MALAT1是位于細胞質,過表達circ-MALAT1后PAX5 mRNA的表達無變化,這表明circ-MALAT1可能在轉錄后水平發揮其調節作用。MALAT1和PAX5可與核糖體結合,裂解轉染circ-MALAT1 IRES突變質粒的Huh7細胞進行RIP分析,來自circ-MALAT1 IRES2突變樣品的抗rps6 RIP產物的數量比IgG對照增加了2- 3倍,而IRES1突變則沒有差異,表明共識IRES1和IRES2的序列(位置640–755)為circ-MALAT1與核糖體結合所必需。生物素標記的PAX5 mRNA特異性探針進行體內RNA下拉實驗,Huh7中PAX5 mRNA的富集水平都相當,circ-MALAT1的富集倍數在突變體遠低于那些在WT中,表明11個堿基對于circ-MALAT1結合PAX5 mRNA至關重要。circ-MALAT1過表達的細胞中PAX5蛋白及其下游蛋白p53的表達下調,PAX5和p53在CSC中被下調。轉染WT circ-MALAT1的細胞中,只有PAX5蛋白表達明顯下調,而轉染了circ-MALAT1 ires2突變體的細胞中,PAX5蛋白表達輕微下調。

5. Circ-MALAT1作為miR-6887-3p海綿上調JAK2
    篩選預測出121個靶向JAK2的miRNA,circ-MALAT1過表達miR-6887-3p表達降低,下拉實驗表明circ-MALAT1特異探針可有效拉低circ-MALAT1,miR-6887-3p也顯著富集。miR-6887-3p模仿物處理的Huh7細胞不影響JAK2 mRNA水平,但JAK2蛋白減少。表明miR-6887-3p可以在轉錄后水平抑制JAK2表達。pMIR-JAK2-3’UTR WT的螢光素酶活性可以被miR-6887-3p模擬有效抑制。circ-MALAT1的過表達減弱miR-6887-3p的JAK2抑制作用,從而增加了JAK2和其磷酸化水平,促進STAT3的磷酸化和激活,JAK2 / STAT3信號通路中的三大關鍵蛋白分子JAK2,磷酸JAK2(p-JAK2)和磷酸STAT3(p-STAT3)在CSC中被上調。

6. Circ-MALAT1在體內吸附miR-6887-3p上調JAK2
    為了進一步驗證miR-6887-3p在體內的特異性,在異種移植腫瘤中用miRNA模擬物或抑制劑進行治療,miR-6887-3p模擬物不影響JAK2 mRNA和circ-MALAT1的表達,JAK2蛋白顯著降低,用miR-6887-3p抑制劑治療又相反趨勢。另外,由于MALAT1減弱了miR-6887-3p對JAK2蛋白的抑制作用,p-JAK2表達增加。以上表明,CSC中的circ-MALAT1上調可以吸附miR-6887-3p,增強JAK2 / STAT3途徑活性促進肝細胞CSC自我更新能力。

7. circ-MALAT1同時作為mRNA翻譯制動器和miRNA海綿促進肝細胞CSCs自我更新


                                                                                                                 

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