CircRNA調控組蛋白修飾在胃癌中的研究
欄目:最新研究動態 發布時間:2020-07-09
胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,迫切需要更有效的生物標志物和靶標以進行更好的診斷和治療胃癌...

    胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,迫切需要更有效的生物標志物和靶標以進行更好的診斷和治療胃癌。circRNA可作為癌癥的潛在診斷生物標志物,并代表新的治療目標。今日這篇文章和大家一起探索circRNA在胃癌中的功能和潛在機制。
技術路線:

結 果:
1.人胃癌組織中環狀RNA (circMRPS35)的鑒定與驗證
    RNA測序分析癌組織和鄰近的正常組織中circRNA表達,13個circRNA在胃癌中明顯下調,有9個上調。在30對胃癌和鄰近正常組織中驗證表達,發現源自MRPS35基因的circ_0000384差異最顯著。發散和聚合引物PCR擴增以及Sanger測序證實circRNA的環狀結構,circMRPS35具有更高的RNA酶抵抗力,轉錄抑制劑Dactinomycin D
處理后circMRPS35比MRPS35 mRNA穩定。以上表明,circMRPS35是在胃癌組織中低表達的穩定circRNA。

2.CircMRPS35表達與胃癌的良好預后相關
    circMRPS35在胃癌組織的表達顯著減少,circMRPS35的表達水平與晚期腫瘤結轉移(TNM)分期、淋巴轉移和腫瘤大小呈負相關,ROC曲線分析表明circMRPS35可用于預測患者的預后。

3.體外CircMRPS35抑制胃癌細胞的增殖和轉移
    為評估circMRPS35的功能,分析circMRPS35在各種人類胃癌細胞系和GES-1細胞的表達。發現circMRPS35水平在SGC7901和MKN28細胞中較低。質粒pCDH-CMVCircMRPS35轉染后,明顯增加,在SGC7901和MKN28細胞中過表達CircMRPS35,抑制細胞生長并誘導細胞周期停滯在G1期,抑制細胞侵襲。siRNA抑制circMRPS35表達,明顯促進細胞增殖、細胞周期加速和侵襲。這些結果驗證circMRPS35可以調節體外培養胃癌細胞的行為。

4.體內CircMRPS35抑制癌細胞的生長和轉移
    在體內,circMRPS35降低異種移植小鼠模型中的腫瘤生長和重量,circMRPS35過表達的腫瘤中Ki-67和PCNA降低,裸鼠肺中的轉移灶降低。shRNA慢病毒抑制CircMRPS35則增加了腫瘤的生長、腫瘤的重量以及Ki-67和PCNA的表達,增加裸鼠肺部轉移灶的數量。

5.CircMRPS35通過FOXO1和FOXO3a的轉錄激活抑制胃癌進展
    circMRPS35敲低后進行RNA序列,GO和KEGG分析表明FOXO信號是circMRPS35參與癌癥調節最相關的信號。FOXO家族是進化保守的,包括FOXO1,FOXO3a,FOXO4和FOXO6四個成員。circMRPS35增加FOXO1和FOXO3a的mRNA和蛋白質水平,CircMRPS35敲低對FOXO1和FOXO3a的磷酸化沒有影響。circMRPS35改變FOXO1和FOXO3a的靶基因(p21,p27,Twist1,E-cadherin)的表達,FOXO1的減少顯著減弱circMRPS35的促進p21和p27表達,挽救細胞周期停滯并抑制細胞增殖。熒光原位雜交表明circMRPS35主要位于細胞核內,circMRPS35增強FOXO1和FOXO3a的啟動子活性??偠灾?,circMRPS35通過轉錄激活FOXO1和FOXO3a抑制胃癌細胞的行為。

6.CircMRPS35的表達與胃癌組織中的FOXO3a和FOXO1對應
    胃癌組織中FOXO1或FOXO3a表達均顯著下降,FOXO1的表達與呈腫瘤大小負相關,FOXO3a表達與晚期TNM階段、淋巴結轉移呈負相關。ROC曲線表明FOXO1和FOXO3a表達可用于預測患者的預后。FOXO1或FOXO3a的低表達與胃癌患者的不良生存密切相關,FOXO1和FOXO3a表達與circMRPS35呈正相關。這些表明circMRPS35介導的FOXO1和FOXO3a信號在胃癌中起關鍵作用。

7.CircMRPS35招募KAT7到FOXO1和FOXO3a基因的啟動子
    進一步研究circMRPS35激活FOXO1和FOXO3a轉錄的機制,細胞裂解物與生物素化circMRPS35探針孵育,RNA下拉測定和質譜分析參與轉錄調控的蛋白質KAT7。在MGC803細胞核中circMRPS35 與KAT7共定位,circMRPS35片段形成多個氫鍵與KAT7殘基相互作用,KAT7(256-315aa)C2H2域對與circMRPS35的相互作用至關重要。FOXO1和FOXO3a啟動子區域中H4K5ac,H4K12ac和H3K14ac的表達富集,ChIP證明只有H4K5ac結合到FOXO3a和FOXO1的啟動子區域,RNA下拉和RIP證明H4K5ac與circMRPS35特異性相互作用,circMRPS35與KAT7和H4K5ac表明circMRPS35與H4K5ac和KAT7相互作用形成三聚體。在circMRPS35 /KAT7/H4K5ac的復合物中,H4K5ac殘基77-84??縆AT7形成的口袋中,H4K5ac具有α-螺旋基序的殘基54–77與KAT7的563-576位殘基相互作用,circMRPS35直接與FOXO1和FOXO3a啟動子區域結合。以上表明circMRPS35將KAT7募集到FOXO1和FOXO3a的啟動子。KAT7的敲低減弱circMRPS35增加的FOXO1和FOXO3a基因啟動子處H4K5ac水平,敲低KAT7大大降低circMRPS35誘導的FOXO1和FOXO3amRNA和蛋白質表達。以上表明,circMRPS35通過招募KAT7增加了FOXO1和FOXO3a啟動子區域中的H4K5的乙?;?。

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